生物药品“植物制造”
 

选择用于生产的植株对于决定产量是关键。常用作物可以分为下列4种不同的植物:多叶的植物,如烟草、紫花苜蓿、莴苣和大豆等;谷类以及荚果类;果实和蔬菜;以及纤维类和油类作物。其中每一种都各有利弊,通常仅作为执行生产重组蛋白功能的载体。

 

        生产蛋白质的烟草

        烟草是在实验室研发水平用来生产重组药用蛋白质时最广泛使用的一种植物。圣路易斯的植物生物工程公司Chlorogen就选择了烟草来生产它的重组蛋白。“烟草已经经过相当长时间的应用了,它的作用类似于实验用的大鼠,”该公司的总裁和首席执行官David  

        Duncan博士说到,“烟草不但很容易进行转化操作,而且还是仅次于甘蔗的地球上第二大生物量生产者。烟草也是一种在一个生长季节能够收获多达5茬的作物,并且在收获后仍然在原始植株上进行再生长。与其它植物比,烟草的另一个优点是自花授粉,因此,即使某一个内在机制如母源性遗传被破坏了,仍然可以有效的降低交叉污染的可能性。”

        引入由感兴趣的基因所编码的蛋白质的过程被称为转化,通常会使用两种手段。一种是通过载体介导,由植物寄生性的土壤农杆菌(Agrobacterium  tumefaciens)介导,向宿主基因组中引入外源性基因。另一种方法是基因枪法,将有DNA包被的微弹加速后射入植物组织中。

        在经历转化过程之后,在各个阶段中基因表达和蛋白质稳定性的效率都需要进行最大化。启动子序列以及多聚腺苷酸信号序列对于高水平的转录都是关键性的影响因子。强大而且构成性表达的花椰菜花叶病毒的启动子35s(CaMV35S)就是经常选用的组织特异性启动子,该启动子仅仅在植物体的特定器官内才具有活性,且具有可以避免在营养器官内发生蛋白质积累的优点,从而防止对宿主植株以及接触非靶点器官后产生毒性。最后,可诱导的启动子能够允许目标蛋白的合成仅发生在某个特定的时期。

亚细胞定位是影响蛋白质生产的另一个重要因素。细胞内的区域化能够影响到蛋白质折叠,聚合,以及转录后修饰的过程。而这些都会影响到蛋白质的稳定性,从而间接的决定最终产量。比较性的定点实验的结果表明利用植物或者动物中使用的N端的信号肽将蛋白定位到分泌途径上,是一处适宜折叠和聚合完整的免疫球蛋白和单链Fv片段的区域。一些对于蛋白质折叠和聚合具有重要作用的因子都出现在内质网的附近:这里是一个氧化性的环境,缺乏蛋白酶,并且含有丰富的分子伴侣。在缺乏定位信号的时候,蛋白质会在细胞外的空间内积累。

 

        定位于叶绿体

        叶绿体是植物体内另一个可供定位的细胞器。已经报道过一些基于叶绿体的分子农业的事例。能够对叶绿体进行遗传转化的重要性是基于以下两个重要的原因。第一,叶绿体是母源性遗传的,因此不会通过花粉传播到其他具有生殖匹配性的植物上。在考虑到基因转移可能造成的环境污染时这将具有重要的意义。第二,与目前使用的细胞核转化植株相比,利用叶绿体进行转化,生产蛋白质要有效数百倍。“回溯到20世纪80年代,人们发现每个细胞内含有约100个线绿体,每个叶绿体内拥有百份左右的DNA拷贝,”Duncan介绍到,“换言之,你就能在一个细胞内获得1万份的外源基因拷贝,我们称之为超表达。”

        但是,叶绿体本身不具有进行大部分转录后修饰作用的能力,如糖基化。因此植物来源的重组蛋白通常缺乏哺乳动物细胞内常见的末端半乳糖残基和唾液酸残基的修饰,却具有糖基化的α-(1,3)岩藻糖和β-(1,2)木糖,前者在哺乳动物细胞内通常形成α-(1,6)的连接方式,而后者未见于哺乳类,而只在无脊椎动物中出现。。这一“外源性”的聚糖结构影响了人体利用和接受植物制造的蛋白。为了改进,研究人员已经在尝试使用纯化的人源性半乳糖基和唾液酸转移酶,在体外条件下修正植物来源的蛋白质。

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